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抗菌肽产品的开发难点

时间:2021-09-29 浏览:1407次
详细说明


抗菌肽


抗菌肽又称抗微生物肽或宿主防御肽,是生物体经诱导产生的具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的一类小分子多肽,属于机体非特异性防御系统的固有组成部分,几乎存在于所有生命形式中。抗菌肽通常由12-50个氨基酸组成,相对分子质量一般在2-5 kDa左右。研究发现,抗菌肽具有快速杀菌广谱抗(kang)菌活性(xing),包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、包膜病毒和肿瘤细胞,并能在先天免疫和获得性免疫之前起到桥梁作用,通过启动获得性免疫系统提高机体抵抗微生态感染的能力。迄今为止,已发现超过3000种抗菌肽。

基于全球无抗政策的推动,抗菌肽无(wu)(wu)残留(liu)、无(wu)(wu)耐药(yao)(yao)性(xing)、无(wu)(wu)配伍禁(jin)忌、无(wu)(wu)停药(yao)(yao)期,无(wu)(wu)毒安全等优势,是现代医学研究最热点之一。目前抗菌肽的生产方式主要有三种:天然提取、化学合成和生物工程发酵。天然抗菌肽主要来自动植物,含量极低,提取过程甚为复杂;化学合成方法高昂,每公斤成本上千万人民币,不适合工业化生产,无法广泛普及应用。生物工程发酵是利用发酵技术实现产业,具备质量稳定、成本低等优势,是业界公认的规模化生产的最佳途径。但商品化抗菌肽开发并非一蹴而就,有以下几个难点。


01


抗菌肽的生物学活(huo)性

目前学术界对抗菌肽的抗菌机制的认识主要有以下两种观点,其一是抗菌肽作用于细胞膜。抗菌肽物理作用于细菌的细胞膜上,使细胞膜穿孔并溢出细胞质,从而达到杀死细菌。抗菌肽具有疏水性和亲水性的两亲性质,因此抗菌肽带正电荷的分子和细胞膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附结合到膜上,然后疏水端将分子插入膜中,从而使整个分子被吸入质膜,这就破坏了蛋白质和脂质在质膜上的原始排列,形成跨膜离子通道,大量离子丢失,细菌无法维持所需的胞内渗透压而死亡。抗菌肽杀菌第二种观点是与细菌胞内的靶点结合,从而达到抑制或杀灭细菌的作用。抗菌肽可以直接作用细胞内关键的生物合成过程,例如抑制DNA复制、RNA转录、蛋白质的合成,抑制细胞壁的合成,改变细胞质膜通透性,抑制合成酶的活性和激活菌体自溶等,如肠杆菌肽抑制细菌的RNA聚合酶。也有一些抗菌肽可以通过影响多个生物合成过程来起到多渠道杀灭细菌。




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在(zai)筛(shai)选(xuan)抗(kang)菌(jun)(jun)肽(tai)的前(qian)期研(yan)发,首先需(xu)要研(yan)究(jiu)抗(kang)菌(jun)(jun)谱,即(ji)抗(kang)菌(jun)(jun)作用的面是否(fou)广泛,是否(fou)和现(xian)有(you)临床疾病(bing)相对应,其次还需(xu)要研(yan)究(jiu)抗(kang)菌(jun)(jun)强度,一(yi)般用最小抑菌(jun)(jun)浓度(MIC)来表示,例如(ru)一(yi)个抗(kang)菌(jun)(jun)肽(tai)对某一(yi)个病(bing)原菌(jun)(jun)有(you)抗(kang)菌(jun)(jun)活(huo)性,但MIC值太高,即(ji)需(xu)要使用超大剂(ji)量(liang)才能(neng)达到(dao)有(you)效(xiao)性,这样(yang)的产(chan)品也(ye)是没有(you)价(jia)值的。如(ru)肠杆菌(jun)(jun)肽(tai)对大肠杆菌(jun)(jun)的MIC<0.5ug/mL,对沙门(men)氏菌(jun)(jun)MIC<0.1ug/mL,抗(kang)菌(jun)(jun)效(xiao)果好(hao)的产(chan)品开(kai)发才会有(you)市场价(jia)值。




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02


抗(kang)菌肽的稳定性(xing)

抗菌肽(tai)产业化应用的另一个问题(ti)就是大部分抗菌肽(tai)稳定还不够理想(xiang),因为抗菌肽(tai)作为多(duo)肽(tai)类物(wu)质,耐高温、耐酸碱性能(neng)不是特别强。


抗菌肽属于生物活性多肽,在生物发酵过程中宿主菌大都会产生很多蛋白酶,这些蛋白酶对多肽有降解的活性,这样就会造成生产出来的抗菌肽在发酵过程中就被降解损耗掉,失去生产价值。在生产过程中,抗菌肽物料还需要由液体经过加工变为固体,这些过程都需要热源,如果一个抗菌肽不耐热,一样失去生产价值。


同时我们开发抗菌肽的作用最重要的一个使用途径是经口给药,抗菌肽有可能被消化道内的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆汁酸等物质会降解,导致无法发挥其生物学活性。对于口服给药的多肽类产品来说,难度是非常大的。


多肽(tai)(tai)(tai)物质(zhi),结(jie)(jie)构决定性(xing)(xing)质(zhi)。如肠(chang)杆(gan)菌肽(tai)(tai)(tai)为(wei)锁套肽(tai)(tai)(tai),其中N端(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)8个氨(an)基(ji)酸形成(cheng)一个圆形的(de)(de)(de)(de)(de)环状结(jie)(jie)构,9-21个氨(an)基(ji)酸形成(cheng)尾(wei)巴,贯穿圆环,故其性(xing)(xing)质(zhi)超级稳定,对高(gao)温、酸、碱、胃(wei)蛋白(bai)(bai)酶、胰蛋白(bai)(bai)酶有良好的(de)(de)(de)(de)(de)抵(di)抗(kang)(kang)(kang)力。枯草菌肽(tai)(tai)(tai)有两(liang)个二硫键(jian),这(zhei)些(xie)空间(jian)结(jie)(jie)构决定了性(xing)(xing)质(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)稳定性(xing)(xing)。当然有些(xie)抗(kang)(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)(tai)本身不稳定,科研工作者为(wei)了解(jie)决这(zhei)个问题(ti),提出(chu)很多方(fang)案(an)以防止抗(kang)(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)(tai)在体(ti)内(nei)被降解(jie),如:分(fen)别(bie)对肽(tai)(tai)(tai)链(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)基(ji)端(duan)(duan)(duan)和(he)羧基(ji)端(duan)(duan)(duan)进行乙酰化和(he)酰胺化修饰(shi)、将线(xian)性(xing)(xing)肽(tai)(tai)(tai)链(lian)进行首(shou)尾(wei)环化处理以提高(gao)稳定性(xing)(xing)、形成(cheng)聚乙二醇(chun)肽(tai)(tai)(tai)增强抗(kang)(kang)(kang)水解(jie)酶能力、脂质(zhi)体(ti)包(bao)裹抗(kang)(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)(tai)使其缓(huan)慢释(shi)放等方(fang)案(an)。这(zhei)些(xie)方(fang)案(an)一定程度上缓(huan)解(jie)了抗(kang)(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)降低,但是带来(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)副作用就是产(chan)量降低,影响活性(xing)(xing)、工艺更加复杂,大大提高(gao)了抗(kang)(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)产(chan)成(cheng)本。




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03


抗菌肽的(de)生产效率(lv)

抗菌(jun)肽具有(you)广阔的(de)应(ying)(ying)用(yong)前景,但是(shi)(shi)在(zai)制(zhi)药、食品(pin)、畜牧(mu)业(ye)(ye)等行业(ye)(ye)中大规模应(ying)(ying)用(yong)的(de)主要问题就是(shi)(shi)生(sheng)产成本太高(gao)。抗菌(jun)肽大规模生(sheng)产的(de)主要限制(zhi)条(tiao)件之一(yi)就是(shi)(shi)成本问题,因此生(sheng)产效率(lv)的(de)高(gao)低直接决(jue)定是(shi)(shi)否可以(yi)大规模应(ying)(ying)用(yong),特别是(shi)(shi)在(zai)农牧(mu)等对成本要求苛刻(ke)的(de)领(ling)域。


前文(wen)分析(xi),天然提(ti)取和(he)化学合(he)(he)成(cheng)都不适合(he)(he)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽的(de)产(chan)(chan)业化,生(sheng)(sheng)物工程发(fa)酵时唯一(yi)可行方法,但也有很多难点(dian)。目前文(wen)献报(bao)道的(de)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽生(sheng)(sheng)产(chan)(chan)水(shui)平(ping)(ping)只有1-150mg /L ,如Chen等(deng)学者(zhe)(zhe)利用SUMo融合(he)(he)表(biao)达技(ji)术在(zai)枯草芽孢(bao)杆菌(jun)(jun)表(biao)达系(xi)统中(zhong)成(cheng)功(gong)表(biao)达了(le)(le)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽 Cecropin AD,摇瓶发(fa)酵液中(zhong)产(chan)(chan)量(liang)为(wei)30.6mg/L;Bi等(deng)在(zai)大肠杆菌(jun)(jun)BL21中(zhong)成(cheng)功(gong)融合(he)(he)表(biao)达了(le)(le)杂合(he)(he)肽LfcinB-Melittin,通过检测发(fa)酵液的(de)含(han)量(liang)为(wei)35mg/L;另有学者(zhe)(zhe)Cao使用毕赤酵母表(biao)达系(xi)统表(biao)达了(le)(le)鸡的(de)防御素Avian β-defensin6,发(fa)酵液中(zhong)含(han)量(liang)达到了(le)(le)114.9mg/L。我国科研人(ren)员在(zai)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽生(sheng)(sheng)产(chan)(chan)水(shui)平(ping)(ping)上实(shi)现了(le)(le)巨大突破,据报(bao)道农(nong)业农(nong)村部饲用抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素替代技(ji)术重点(dian)实(shi)验(yan)研究的(de)抗(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽发(fa)酵水(shui)平(ping)(ping)是(shi)文(wen)献报(bao)道的(de)100倍左右。




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04


抗菌肽的纯化工艺

抗菌肽纯品的获取很难。抗菌肽的分离纯化是获取过程中的一项关键环节,不管是天然的抗菌肽,还是基因工程技术获得的抗菌肽,抗菌肽在分离纯化基质中的占比都很小,存在大量的杂蛋白及其他物质,对于成分未知或者结构复杂的抗菌肽就难度更大。所以,分离纯化抗菌肽的关键在于不仅要得到单一的多肽,而且要保证获取多肽的生物学活性,这是进行下一步科学研究的基础。抗菌肽是一类小分子多肽,不同多肽的氨基酸序列及空间结构不同,导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异,利用待分离多肽与其它蛋白质性质上的差异,即可以设计出一套合理的多肽纯化方案。在发酵液中,抗菌肽的占比不到1%,如果去掉99%的杂质,获得纯度大于99.6%的抗菌肽单体是一项艰巨的科研工程。

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05


建立抗菌肽检测(ce)质量标准

关于抗菌肽的评价方法有两大类,一类是检测抗菌肽的抗菌活性;主要使用扩散法测定。原理是不同浓度的抗菌肽与作用于培养基中的菌种,抗菌肽杀死细菌从而会形成大小不同的抑菌圈,根据圈的大小,就可判定出抗菌肽的抗菌活性。同样,一般在0.5麦氏浓度的菌悬液中加入不同浓度的抗菌肽,抗菌肽会不同程度的影响菌悬液的生长,根据吸光度的高低,可以判断抗菌活性的强弱。抗菌活性检测方法最大的问题是无法区分微生物发酵液中其他组分对抑菌结果的影响,如发酵液的培养基、pH等都会有一定的抑菌活性。更有甚者,在产品中加入其它抑菌物质冒充抗菌肽。这种抗菌活性检测方法操作简单,人员设备要求低,是目前大多数抗菌肽研究所采用的方法,但不能确定产品中是否真实含有抗菌肽,只能表明该产品由抑菌活性。在抗菌肽的质量标准建立过程中,该方法只能作为辅助使用。


一类(lei)是(shi)定(ding)性定(ding)量检(jian)测方法,一般用的是(shi)高效液相色谱法和毛细管电泳。毛细管(guan)电(dian)泳设备投资(zi)大,一般研究单位使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)较少。HPLC对混合(he)(he)物(wu)中(zhong)复(fu)杂组分(fen)的(de)(de)(de)(de)分(fen)离(li)能力(li)强,也(ye)可以(yi)与其他技术联合(he)(he)使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)对物(wu)质(zhi)进行(xing)准确的(de)(de)(de)(de)定性(xing)(xing)、定量分(fen)析。不同理化性(xing)(xing)质(zhi)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)肽可以(yi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)不同分(fen)离(li)原理的(de)(de)(de)(de)色(se)谱(pu)进行(xing)分(fen)离(li),如(ru)(ru)极性(xing)(xing)大的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)肽可以(yi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)亲水色(se)谱(pu)进行(xing)分(fen)离(li),不同电(dian)荷(he)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)菌(jun)肽可以(yi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)离(li)子(zi)交换(huan)色(se)谱(pu)分(fen)离(li),但科研工作中(zhong)最(zui)常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)还是反向高效(xiao)液相色(se)谱(pu)法,也(ye)是学术界公认的(de)(de)(de)(de)多肽类物(wu)质(zhi)检测最(zui)科学的(de)(de)(de)(de)方法。如(ru)(ru)李波研究了高效(xiao)分(fen)泌天蚕素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)枯草芽孢(bao)杆菌(jun)宿主(zhu)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)中(zhong)试发酵工艺,用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)反向高效(xiao)液相色(se)谱(pu)法检测天蚕素(su)(su)含量达到961.52μg/m L。




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06


研发投(tou)入成本高

抗菌肽属于多(duo)肽类生物药,一(yi)种(zhong)新药从(cong)最初发(fa)现(xian)先导化合物到最终上(shang)市(shi),需要经历漫长过程。前瞻产业研(yan)究院报告显示(shi),国(guo)际(ji)上(shang)一(yi)种(zhong)新药的成(cheng)本已经超(chao)过10亿美元(yuan),研(yan)发(fa)周期超(chao)过10年。但(dan)与发(fa)达(da)国(guo)家相比(bi),我(wo)国(guo)创新药物研(yan)发(fa)仍(reng)处(chu)于劣(lie)势(shi),无(wu)论(lun)是(shi)研(yan)发(fa)投入能力还(hai)是(shi)产出方面与发(fa)达(da)国(guo)家均有(you)一(yi)定差距。新药研(yan)发(fa)资金需求高(gao)、投入时间长,需要政策(ce)与资本的双重支持(chi)。


综上(shang)所述(shu),抗(kang)菌(jun)肽(tai)产品(pin)的(de)(de)开发(fa)困难重重,需要广大科(ke)研(yan)工作(zuo)者攻(gong)坚克难。随着(zhe)抗(kang)菌(jun)肽(tai)研(yan)究(jiu)的(de)(de)不(bu)断深(shen)入以及生物技术的(de)(de)发(fa)展(zhan),希望未来有更(geng)多、更(geng)好的(de)(de)抗(kang)菌(jun)肽(tai)产品(pin)能够产业化,从而(er)能够促进(jin)整个医药行业的(de)(de)发(fa)展(zhan)。

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